DEȚINE DISERTAREA DOCTORALĂ ROLUL POLIMERASEI (ADP-RIBOSE) POLIMERAZĂ-1 ȘI 2 ENZIME ÎN REGULAREA FACTORILOR DE TRANSCRIPȚIE METABOLICĂ

DEȚIN DE DOCTORAT ROLUL POLI (ADP-RIBOSE) POLIMERAZA-1 ȘI 2 ENZIME ÎN REGULAREA FACTORILOR DE TRANSCRIPȚIE METABOLICĂ PÉTER BAY UNIVERSITATEA DEBRECEN 2013 FACULTATEA DE MEDICINĂ GENERALĂ DEPARTAMENTUL DE MEDICINĂ.

4.2. Cum afectează enzima PARP-2 funcția organelor și țesuturilor metabolice? 42 4.2.1. Fenotiparea metabolică a șoarecilor PARP-2 -/- 42 4.2.2 Efectul ștergerii PARP-2 asupra funcției țesutului adipos alb 42 4.2.3. Examinarea organelor de eliberare a energiei (țesut adipos maro, mușchi striat) 45 4.2.4. Modificări biochimice la nivelul ficatului după deleția PARP-2 49 4.2.5. Examinarea răspunsului șoarecilor PARP-2 -/- la o dietă bogată în grăsimi 50 4.2.6. Investigația funcției pancreatice endocrine la șoarecii PARP-2 -/- 51 4.3 Ștergerea PARP-2 poate oferi protecție împotriva deteriorării oxidative? 55 5. Discuție și perspective 60 5.1. Mecanismul molecular al rolului metabolic al PARP-1 și PARP-2 60 5.2. Rolul enzimelor PARP-1 și PARP-2 în țesuturile metabolice 64 5.3. Consecințele inhibiției farmacologice a PARP 66 5.4. Interacțiuni între enzimele PARP și căile senzorilor de energie 66 5.5 Relațiile dintre enzimele PARP și bolile metabolice 67 5.6. Interacțiunea enzimelor PARP și a enzimelor sirtuin ca răspuns la stresul oxidativ 70 5.7 Interacțiuni suplimentare între sirtuină și enzimele PARP 73 7. Rezumatul noilor rezultate științifice prezentate în disertație 75 9. Referințe 81 10. Aplicații de sprijin 100 4

TBARS Substanțe reactive ale acidului tiobarbituric TFAM factor de transcripție mitocondrială A TR receptor de tiroidă TropI de tip I troponină TUNEL - Terminal deoxinucleotid transferază dutp nick final marcare UCP decuplare proteină 7

mtsai, 2007); PPARγ troglitazonă (TZD, 5 μm). Β-Estradiol (10 μm) a fost utilizat pentru a activa receptorul de estrogen β (ERβ). 23

Masa 2. Detalii despre procedurile utilizate în testele de reporter luciferază Experiment Linie celulară Constructe (nume, cantitate) Incubare PARP-2 expresie HEK293T 0,6 μg psuper-siparp-2/psuperscrparp-2/pbabe/pbabe-parp-2 Efect de 6 h asupra transactivării PPARα 1 μg psg -pparα 1 μg pgl3- (j wt) 3 TKluc 0,4 μg pcmv-βgal PARP-2 expression HEK293T 0,6 μg psuper-siparp-2/psuperscrparp-2/pbabe/pbabe-parp-2 6 h efect pe transactivarea PPARγ 1 μg psg-pparγ 1 μg pgl3- (j wt) 3 TKluc 0,4 μg pcmv-βgal PARP-2 expression HEK293T 0,6 μg psuper-siparp-2/psuperscrparp-2/pbabe/pbabe-parp-2 6 ore efect pe transactivarea PPARδ 1 μg psg-pparδ 1 μg pgl3- (j wt) 3 TKluc 0.4 μg pcmv-βgal PARP-2 expression HEK293T 0.6 μg psuper-siparp-2/psuperscrparp-2/pbabe/pbabe-parp- 2 6 h effect on ERβ transactivation 1 μg psg- ERβ 1 μg vitellogenina2-ere-tkluc 0,4 μg pcmv-βgal PARP-2 expression HEK293T 1 μg of psuper-shparp-2/psuper- 10 h effect on SIRT1 promoter scrparp- 2/pbabe/pbabe- PARP-2 1,6 μg Raportul promotorului SIRT1 er 0,4 μg pcmv-βgal Efectul expresiei PARP-2 asupra promotorului SIRT1 MOVAS 8 μg reporter promotor SIRT1-91 4 μg pcmv-βgal 48 h 24

Km SIRT1 (Ame și colab., 1999; Houtkooper și colab., 2010), prin urmare, este puțin probabil ca activarea PARP-2 să reducă în mod adecvat substratul NAD + din SIRT1 și, prin urmare, ne putem confrunta cu un mecanism molecular diferit de cel al efectul ștergerii PARP-1. În toate modelele utilizate, s-a observat o creștere a expresiei SIRT1 pentru ștergerea PARP-2 și PARP-2 s-a dovedit a fi un represor al promotorului SIRT1. În absența articolului 61

S-a demonstrat că PARP-2 promovează închiderea structurii cormatinei, apariția heterocromatinei. Liang și colab. (Liang și colab., 2013) au arătat că PARP-2 duce la acumularea de histone deacetilaze HDAC5 și HDAC7 și histon metiltransferază G9a la promotorii săi reprimați și creează un model de acetilare și metilare caracteristic cromatinei reprimate. Același grup (Liang și colab., 2013) a arătat în continuare că acumularea acestor enzime modificatoare de histone este independentă de activitatea enzimatică a PARP-2. Ar trebui să adaug că, în absența PARP-2, un grad ridicat de rearanjare a expresiei genelor a fost descris de Farres și colab. (Farres și colab., 2013). În propriile noastre experimente de microarray raportate, am observat modificări în expresia a peste 600 de gene după epuizarea PARP-2. Printre ei

Expresia a 450 de gene a scăzut în timp ce

Mecanism de apărare mitocondrială similar cu ștergerea PARP-2. Acest lucru se datorează probabil faptului că expresia PARP-1 este foarte scăzută în ficat (

activare și scăderea consecventă a expresiei PDX1 (Kitamura și colab., 2002). În orice caz, hipofuncția pancreatică la șoarecii PARP-2 -/- este neașteptată, deoarece supraexprimarea SIRT1 îmbunătățește secreția de insulină în pancreas prin îmbunătățirea funcției mitocondriale (Bordone și colab., 2006; Moynihan și colab., 2005). O explicație a discrepanței poate fi că rezultatul celor două efecte (inhibarea PDX1 și inducerea biogenezei mitocondriale) dictează comportamentul celulelor beta, care sunt prezente în proporții diferite în cele două modele. Datorită predominanței dezacetilării FOXO1 (și a inhibării PDX1 în consecință) din cauza supraexprimării SIRT1 scăzută după deleția PARP-2, inhibarea proliferării devine dominantă. În contrast, în cazul supraexpresiei ridicate a SIRT1 (în cele două studii marcate, expresia

5.7 Interacțiuni suplimentare între sirtuină și enzimele PARP Se poate pune întrebarea dacă enzimele sirtuinei, altele decât SIRT1, interacționează cu PARP-1 sau PARP-2. Am arătat că ștergerea PARP-1 sau administrarea unui inhibitor PARP nu a modificat activitatea SIRT2 citoplasmatic și SIRT3 mitocondrial. Probabil că nu s-a observat nicio modificare, deoarece creșterea nivelurilor de NAD + cauzată de inhibarea activității PARP-1 a fost limitată la compartimentul NAD + nuclear și nu a afectat concentrația de NAD + în compartimentele citoplasmatice sau mitocondriale considerate izolate. Efectul PARP-2 a fost, de asemenea, limitat la SIRT1, care poate fi atribuit specificității modificărilor transcripționale. Alte enzime din familia PARP pot juca, de asemenea, un rol în reglarea metabolică. Enzimele PARP cu roluri metabolice cunoscute sunt rezumate în Tabelul 4. 73

Bai P, Cantó C. Rolul enzimelor PARP în reglarea metabolică și boală. Cell Metab. 16 (5) 290-295. IF: 14,619 Szántó M, Brunyánszki A, Kiss B, Nagy L, Gergely P, Virág L, Bai P (2012) Poly (ADP-riboză) polimerază-2: roluri transcripționale emergente ale unei proteine de reparare a ADN-ului. Științele vieții celulare și moleculare 69 (24): 4079-4092. IF: 5.615 77

Bai P, Cs. Hegedűs, K Transylvania, Szabó E, Bakondi E, Gergely Sz, Szabó Cs, Virág L (2007) timocite: implicație pentru citotoxicitate. Scrisori de toxicologie 170 (3), 203-213. IF.: 2.826 Erdelyi K, Kiss A, Bakondi E, Bai P, Szabo C, Gergely P, Erdodi F, Virag L. (2005) Gallotanina inhibă expresia chemokinelor și citokinelor inflamatorii în celulele A549. Farmacologie moleculară 68 (3), 895-904. IF: 4.612 80

Lucrări discutate în disertație