Proceduri avansate de testare și opțiuni terapeutice în distrofia maculară Stargardt

Recomandați documente

Proceduri moderne de examinare și posibilități terapeutice în distrofia maculară Stargardt Disertație de doctorat

Dr. János Hargitai Semmelweis University Doctoral School of Clinical Medicine

Supervizor: Dr. Ágnes Farkas Judecători oficiali: Dr. László Kőhidai Dr. Ágnes Kerényi Președintele Comitetului de examinare: Membrii Comitetului de examinare:

Dr. Béla Szende Dr. Gábor Radó Dr. Ákos Lukáts

Cuprins 1. Lista abrevierilor

4.1. Investigarea modificărilor morfologice ale retinei Stargardt

în distrofia maculară prin coerență optică cu tomografie 4.2. Modificarea pigmentului macular a fost examinată de Stargardt în distrofia maculară utilizând o oftalmoscopie cu laser de scanare. 4.3. Examinarea genei ABCA4 în distrofia maculară maghiară Stargardt

și compararea acestuia cu fenotipul pacientului 4.4. Posibilități de livrare a genei GFP în epiteliul pigmentar retinian și

țesuturile retiniene in vitro și in vivo 4.4.1. Crearea vectorului de virus

4.4.2. Cultură de celule epiteliale pigmentare retiniană

4.4.3. Transducție in vitro

4.4.4. Transducție in vivo

4.4.4.1. Transducție in vivo fără imunosupresie

4.4.4.2. Transducție in vivo prin imunosupresie

4.4.5. Test ELISA

4.4.6. Examinarea in vivo a retinei

4.4.7. Examinări histologice

5.1. Investigarea modificărilor morfologice ale retinei Stargardt

în distrofia maculară prin coerență optică cu tomografie 5.2. Stargardt a examinat modificarea pigmentului macular

în distrofia maculară utilizând scanarea cu oftalmoscop cu laser 5.3. Examinarea genei ABCA4 în distrofia maculară maghiară Stargardt

grupul de pacienți și compararea acestuia cu fenotipul pacientului 5.4. Posibilități de livrare a genei GFP în epiteliul pigmentar retinian și țesuturile retiniene in vitro și in vivo

5.4.1. Transducție in vitro

5.4.1. Transducție in vivo

5.5. Este potrivit pentru combaterea răspunsului imun provocat de proteina GFP

examinarea metodelor 6. Discuție

6.1. Investigarea modificărilor morfologice ale retinei Stargardt

în distrofia maculară prin coerență optică cu tomografie 6.2. Stargardt a examinat modificarea pigmentului macular

în distrofia maculară utilizând un oftalmoscop cu laser de scanare 6.3. Examinarea genei ABCA4 în distrofia maculară maghiară Stargardt

și compararea acestuia cu fenotipul pacienților 6.4. Posibilități de livrare a genei GFP în epiteliul pigmentar retinian și

țesuturile retiniene, in vitro și in vivo 6.5. Este potrivit pentru combaterea răspunsului imun provocat de proteina GFP

examinarea metodelor 7. Rezultate noi și semnificația lor clinică

12. Lista publicațiilor

12.1. Publicații legate de tema disertației

12.2. Alte comunicări

12.3. Rezumatele pot fi citate pe tema disertației

12.4. Prelegeri pe tema disertației

13. Copii ale publicațiilor legate de tema disertației

1. Lista abrevierilor ABCR: ATP-ase legator casette reporter AMD: degenerescență maculară vârstnică ATP: adenozin trifosfat A2E: N-retinilidin-N-retinil-etanolamină CMV promotor: citomegalovirus promotor CRD: distrofie pin-stick DMEM: E modificat de Dulbecco: proteină fluorescentă verde îmbunătățită ELISA: test imunosorbent legat de enzime EPON: material de încorporare histologic ERG: electroretinografie FACS: sortare celule fluorescente FT: grosime foveolară GFP: proteină fluorescenică verde HRP: hrean peroxidază HSV virus herpes siplex MV: volum macular OCT: tomografie de coerență optică Compus OCT: material de înglobare histologică la temperatură scăzută (pentru secțiuni înghețate) PBS: soluție salină tamponată cu fosfat RAL-PE: fosfatidil entanolamină retiniană RmP: proteină de margine RP: retinită pigmentară SLO: oftalmoscop cu laser de scanare STGD: distrofie maculară Stargardt (Distrofia maculară Stargardt) TBS: soluție tampon trishidroximetilaminometan UV: ultraviolet

2. Introducere Cea mai comună distrofie maculară simptomatică moștenită la o vârstă fragedă a fost descrisă de Karl Stargardt în 1907 (Stargardt 1909, 1918). Un simptom caracteristic al bolii este scăderea vederii centrale, care apare de obicei înainte de vârsta de douăzeci de ani. Acuitatea vizuală îndepărtată în starea finală a bolii se stabilizează de obicei între citirile degetelor de 2-3 metri și 0,1 (Markham și colab. 1998). Capacitatea de citire este grav afectată, dar nu este însoțită de o vedere afectată a culorii. Răspunsurile Ganzfeld ERG ale pacienților sunt caracterizate de o predominanță a afectării funcției fotopice, dar prelungirea adaptării la întuneric este, de asemenea, o plângere obișnuită. Într-un stadiu incipient, imaginea fundului nu este întotdeauna patognomică, iar diagnosticul clinic poate fi adesea pus doar pe măsură ce boala progresează pe baza unor pete caracteristice de culoare alb-gălbuie de „slim de melc” și/sau leziuni maculare atrofice „de bronz bătut”. (Figura 1)

Figura 1. Distrofia maculară „melc melc” și „bronz bătut” (Hargitai și colab. 2005) Incidența bolii este estimată la 1: 10000; este moștenit într-un mod predominant autosomal recesiv, rareori autosomal dominant. (Figura 2) Frecvența de apariție 1: 10000 1: 10000-1: 15000 nu există date disponibile 1: 5000-1: 25000

Distrofia maculară Stargardt Distrofia progresivă a pinului Cea mai bună distofie macelară viteliformă Retinoschisis legată de X

Tabelul 1. Cele mai frecvente distrofii maculare moștenite

În 1997, Allikmets și colegii săi au descoperit o genă care era defectă în bolile autozomale.

(Kaplan și colab. 1993; Allikmets 1997 și colab.). Gena ABCR este localizată pe cromozomul 1 și este responsabilă pentru codificarea unei proteine transmembranare, proteina „rim” (RmP), un membru al familiei de transportoare de casete care leagă adenozin trifosfatul (ATP) (Azarian și colab. 1997). Proteina RmP a fost descrisă mai întâi în membrul exterior al celulelor pin broască (Papermaster și colab. 1978). Această proteină este un fotoreceptor

implicat în procesele de transport (Weng et al. 1999).

Figura 2. Funcția proteinei RmP (rho: rodopsină; ops: opsin; PE: fosfatidilenatolamină; atRAL: retiniană all-trans; arROL: retinol all-trans; N-RPE: N-retinidil-fosfatidilenatolamină; DM: membrana plachetară PM: membrana plasmatică) Weng și colab. 1999. Când este expusă la lumină, rodopsina eliberează retina all-trans în trombocitele membrelor exterioare. Retina All-trans se leagă de fosfatidiletanolamină (PE) din membrana plachetară. Produsul rezultat este N-retinilidină-PE (N-retPE). În cazul funcționării sănătoase a RmP, N-ret-PE este eliminat de pe trombocite și apoi retina all-trans este convertită în retinol all-trans (atROL), care este din nou convertit în 11-cis-retinal prin epitelial pigmentar celule. (Figura 2) Dacă proteina RmP lipsește sau nu funcționează corect, N-ret-PE se acumulează în spațiul dintre trombocite. O consecință a acumulării va fi că opsina este activată de cantitatea mare de exces de retină all-trans din trombocite, având ca rezultat formarea retinei ops-full-trans (ops/atRAL). Aceasta este 6

superoxid dismutază) și antioxidanți solubili în apă (glutation, vitamina C) (Conn și colab. 1993; De La Paz și colab. 1992). Retina este deosebit de sensibilă la stresul oxidativ, deoarece are o concentrație foarte mare de oxigen și este expusă la lumină albastră continuă cu energie ridicată. Moleculele care absorb într-o mare măsură lumina UV și albastră, cum ar fi, de exemplu, joacă un rol cheie în formarea speciilor reactive de oxigen. lipofuscina. Acești radicali de oxigen provoacă peroxidarea lipidelor prin deteriorarea acizilor grași nesaturați cu lanț lung, care 10

poate conduce (Winkler și colab. 1999). Carotenoizii joacă un rol important în eliminarea radicalilor liberi (Stahl și colab. 1997; Leibler și colab. 1997; Sundelin și colab. 2001). Datorită solubilității lor lipidice, acestea se leagă de membranele celulare și sunt pilonii de protecție a membranelor cu acizi grași nesaturați în membrul exterior al fotoreceptorilor (Winkler și colab. 1999; De La Paz și colab. 1992; Leibler și colab. 1997 ). Moartea progresivă a celulelor epiteliale a pigmentului, scăderea pigmentului macular și acumularea de lipofuscină duc la deteriorarea oxidativă a retinei și, prin urmare, la scăderea acuității vizuale (Boulton și colab. 1991; Curcio și colab. 1993). În condiții experimentale, culturile de celule pigmentare tratate cu luteină și zeaxantină au reușit să reducă formarea lipofuscinei și apoptoza indusă de lumina albastră (Boulton și colab. 1993). Utilizarea continuă a suplimentelor alimentare care conțin luteină și zeaxantină duce la o creștere a conținutului de xantofilă în sânge și mai târziu în retină. Unele studii au arătat că concentrațiile serice mai mari de xantofilă duc la o rată mai mică de degenerescență maculară la bătrânețe (Seddon și colab. 1995; Snellen și colab. 2002; Gale și colab. 2003). THE

studiile sunt în curs. În prezent, boala Stargardt, împreună cu alte distrofii maculare, este o boală incurabilă. Aceste boli pun o povară grea asupra pacientului, familiei sale și societății în ansamblu. Diagnosticul precoce îi poate ajuta pe cei implicați să se integreze mai ușor în societate și să ducă o viață plină cu alegerile corecte de carieră. Până în prezent, singura terapie recomandată pentru STGD este utilizarea formulărilor multivitaminice care conțin vitamine, oligoelemente, antioxidanți și fotopigmenti care inhibă îmbătrânirea timpurie a retinei și a fotoreceptorilor în compoziții adecvate. Opțiunile noastre cele mai frecvent utilizate de reabilitare optică sunt în prezent următoarele ajutoare: binoclu, televizor cu mărire și ochelari cu filtru color (Fonda și colab. 1985; Zrenner și colab. 2002). În paralel cu extinderea posibilităților de diagnostic ale bolilor retiniene, au fost începute tot mai multe experimente cu scopul de a vindeca bolile (Rattner și colab. 1999).

toate componentele virale esențiale pentru transducție au fost eliminate din vectorul adenovirus îmbunătățit „fără intestine”, dar proteina capsidei virale continuă să obțină un răspuns imun (Sakhukja și colab. 2003; Kochanek și colab. 2001; McKelvey și colab. 2004). Un alt dezavantaj al vectorului adenovirus este că transgenul este integrat episomal, astfel încât expresia continuă a genei pentru tratamentul bolilor cronice nu este atinsă, dar genomul celulei țintă nu este modificat ca urmare a terapiei. Virusul adeno-satelit (AAV) are potențialul de a trata o gamă largă de celule țintă (Kaplitt și colab. 1994; Lu și colab. 2004). Dimensiunea transgenului „implantabil” este mică (4-5kb) și vectorul nu provoacă un răspuns imun. Dacă este necesară livrarea unui transgen mai mare, rezultatele pot fi obținute numai prin fragmentarea genei, transducția simultană a doi vectori AAV (Nakai și colab. 2000; Duan și colab. 2000; Sun și colab. 2000).

grupurile de celule neuronale îndepărtate sau închise pot fi tratate (Dull și colab. 1998; Kim și colab. 1998; Poeschala și colab. 1998; Rohll și colab. 2002). Vectorii lentivirali recenți sunt capabili să „activeze și să dezactiveze” expresia transgenică utilizând sistemul de reglementare Tet (tetraciclină) (Pluta și colab. 2005). Această proprietate poate fi deosebit de importantă în tratamentul unei boli acute. În prezent, experimentele de terapie genetică folosind un vector lentiviral sunt în desfășurare în următoarele boli neurodegenerative, printre altele: boala Alzheimer (Marr și colab. 2003), boala Parkinson (Kirik și colab. 2004), boala Huntington (Kells și colab. 2004), și scleroza laterală amiotrofică (Kaspar și colab., 2003). Ochiul poate fi un organ țintă ideal pentru terapia genică în mai multe moduri: este ușor accesibil chirurgical și terapia poate fi ușor monitorizată in vivo. În mai multe boli moștenite ale retinei, anatomia parțială și reabilitarea funcțională au fost realizate în modele animale în ultimii ani (amauroza congenitală a lui Leber, retinita pigmetosă, distrofia maculară a lui Stargardt) (Takahashi și colab. 1999; Acland și colab. 2001; Bemelmans și colab. 2006 Kong și colab., 2007).

Un model animal experimental al bolii Stargardt este șoarecele „knock out” abcr -/- în care gena proteinei RmP a fost ștearsă. Acumularea lipofuscinei și prelungirea adaptării la întuneric au fost descrise la acești șoareci (Weng și colab. 1999). Studiile efectuate pe șoareci abcr -/- au arătat că acumularea A2E este redusă atunci când animalele sunt ținute în întuneric (Weng și colab. 1999). Pe baza acestui fapt, putem sfătui pacientul să evite cât mai multă lumină puternică. S-au făcut încercări de a dezvolta medicamente care inhibă acumularea A2E în celulele epiteliale pigmentare. Un astfel de efect al izotretinoinei a fost demonstrat la șoareci abcr -/- (Radu și colab. 2003).

evaluarea progresiei cu noi instrumente de diagnostic oftalmic, precum și cartografierea fundalului genetic al bolii și studiul in vitro și in vivo al intrării unei proteine trasoare prin terapia genică. În cercetarea noastră am căutat răspunsuri la următoarele întrebări: 1.

Este OCT o metodă adecvată pentru studierea modificărilor morfologice ale retinei în distrofia maculară Stargardt?

2. SLO poate fi utilizat pentru a urmări modificările pigmentului macular în distrofia maculară Stargardt? 3. Ce mutații ale genei ABCA4 apar cel mai frecvent în grupul de pacienți cu distrofie maculară maghiară Stargardt și cum afectează acestea fenotipul pacienților? 4. Este vectorul lentivirus capabil să introducă gena proteinei fluorescente verzi a GFP în epiteliul pigmentar al retinei și în alte straturi in vitro și in vivo? 5. Ce metodă este potrivită pentru combaterea răspunsului imun provocat de proteina GFP?

Pentru procesarea statistică, utilizând regresia liniară, a fost utilizat software-ul Statistica 6.0 (Statsoft Inc. Tusla, SUA) și nivelul de semnificație ap A ND L541P/A1038V G1961E 106delT G1961E ND ND L541P/A1038V G863A IVS40 + 5GE N 59DdG G ND ND ND IVS40 + 5G> A 5917delG L541P/A1038V D1532N ND ND L541P L541P/A1038V L541P/A1038V G863A L541P/A1038V ND G1961E ND ND ND P68L L541P/A1038V ND ND ND ND ND ND L541 5G> A

II. Tabelul F: feminin; M: bărbat; I, II, III: evaluarea leziunilor fundusului în funcție de clasificarea lui Fischmann; FT: grosimea foveolei; MV: volumul maculei; ND: Nu a fost detectată nicio anomalie genetică. (Harghita 2005)

Cea mai bună corecție vizuală corelată s-a corelat semnificativ atât cu grosimea foveolară (Fig. 8), cât și cu volumul macular (Fig. 9).