ȘCOALA DOCTORALĂ KÁLMÁN KERPELY

ȘCOALA DOCTORALĂ KÁLMÁN KERPELY Supraveghetori: prof. Dr. István Pócsi doctor al Academiei maghiare de științe prof. Dr. János Nagy doctor al Academiei maghiare de științe KLUYVEROMYCES MARXIANUS DEZVOLTAREA DEZEURILOR DE LIVRĂ Doctor Debrecen PRODUCȚIA BÉETANOL - OBIECTIV BIOETAN

(Drd.) Tulpini de drojdie K. marxianus DEZVOLTAREA PRODUCȚIEI DE BIOETANOL PENTRU disertație pentru obținerea unui doctorat Scris de domeniul cercetării agricole: biolog Eva Forest/biotehnolog pregătit în cadrul Școlii de absolvire Kálmán Debrecen Kerpely (botanică a programelor de culturi și doctorat) Supraveghetori: prof. Dr. István Pócsi și prof. Dr. János Nagy Comitetul de examinare doctorală: Nume președinte: prof. Dr. Botond Sinóros-Szabó Membri: dr. György Dénes Bisztray dr. Tamás Rátonyi Data examinării doctorale: 15 iunie, 2011 11:00. Poate sa. grad DSc. Dr. Dr. Recenzori ai disertației: nume. Poate sa. grad. Juriul: Name Knows. grad Semnătura președinte. Membri. Secretar. Data apărării disertației: 2011 2

4.2.1. Determinarea conținutului de trehaloză. 57 4.2.2. Determinarea conținutului GSH și GSSG. 59 4.2.3. Teste de toleranță la stres. 60 4.2.4. Investigarea proteinelor de stres termic. 62 5. CONCLUZII, SUGESTII. 64 6. REZULTATE ȘTIINȚIFICE NOI ȘI INOVATIVE. 66 7. REZUMAT (în limba maghiară). 67 8. REZUMAT (în engleză). 70 9. LISTA PUBLICAȚIILOR. 72 10. PUBLICAȚII PRIVIND TEMA DISERTAȚIEI. 87 11. MULȚUMIRI. 89 12. DECLARAȚII. 90 5

LISTA ABREVIERILOR CBS NCYC YPD YM OD HP HPTLC ku DCM GSH GSSG GR EDTA DTNB NADPH BSA PMSF SDS SDS-PAGE TRIS TEMED APS RSM Centraalbureau voor Schimmelcultures National Collection of Yeast Culture Extract de drojdie, Peptonă, Dextroză optică, Dextroză densitate Hewlett Packard, sub presiune, strat subțire, cromatografie, kilogram Unitate de conținut de substanță uscată, glutation oxidat, glutation glutation reductază, acid etilendiaminetetraacetic, acid 5,5-dimio-bis (acid 2-nitrobenzoic), nicotinamidă, adenină, dinucleotid, fosfat de vițel, albumină, fluorură de sodiu dodecil sulfat SDS-poliacrilamidă gel electroforeză tris (hidroximetil) aminometan, N-tetrametiletilendiamidă amoniu Persulfat Metodă de suprafață de răspuns 6

În cele din urmă, examinarea mutantului termotolerant K. marxianus prin metode fiziologice microbiene: - Determinarea conținutului de trehaloză intracelulară. - Determinarea conținutului GSH, GSSG. - Detectarea proteinelor de șoc termic. - Studiu privind toleranța la stres la etanol, oxidativ și osmotic. 9

Distingem un grup pe baza materiei prime și a tehnologiei utilizate pentru producția lor: biocombustibili din prima, a doua și a treia generație (Figura 1). Figura 1: Gruparea biocombustibililor (după Nigam și Singh, 2011) Deși biocombustibilii au o serie de avantaje, există încă o serie de provocări pentru țări în ceea ce privește producția și comerțul. Mai presus de toate, trebuie stabilite instalații de depozitare și rețele de transport adecvate și viabile din punct de vedere economic pentru materia primă. Dezvoltarea unei tehnologii adecvate de producție este, de asemenea, esențială pentru o funcționare eficientă. Este necesar să se introducă noi legi privind rata de amestecare a biocombustibililor, subvențiile și posibilele stimulente fiscale. 2.1.1.1. Biocombustibili de prima generație Biocombustibilii de prima generație sunt produși din cereale și alte culturi cu conținut diferit de zahăr sau amidon, cum ar fi porumb (Nicolic și colab., 2010; Mojovic și colab., 2006), grâu (Talebina și colab., 2010) și orez (Când-Hua C. 11

Figura 2: Tehnologie SHF (hidroliză și fermentare separată) (după Wright, 1988). Figura 3: Tehnologia SSF (zaharificare și fermentare simultană) (după Wright, 1988). 20

Figura 4: Relația filogenetică și unele caracteristici ale Kluyveromyces marxianus și drojdii înrudite. Sursa: Lane și Morrissey, 2010 și baza de date de colectare a culturii Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) (http://www.cbs.knaw.nl/) Ploidia genului Kluyveromyces, inclusiv K. marxianus, nu este pe deplin elucidată. În mod tradițional, speciile aparținând acestui gen au fost considerate uniform haploide (Johannsen, 1980; Steensma și colab., 1998), dar publicațiile recente care conțin lucrări moleculare sugerează că acest lucru nu este întotdeauna cazul. De exemplu, o publicație publicată de Ribeiro și colab. (2007) sugerează că tulpina utilizată pe scară largă K. marxianus CBS 6566 este diploidă. Toate acestea indică faptul că formele haploide și diploide ale K. marxianus pot fi prezente și în cercetare și în procesele tehnologice industriale (Hong și colab., 2007; Nonklang și colab., 2009). 2.5.2. Semnificația biotehnologică și aplicabilitatea lui K. marxianus În primul rând, este important de menționat că majoritatea studiilor asupra tulpinilor K. marxianus nu au considerat studiul biochimiei, metabolismului sau fiziologiei tulpinii drept obiectivul său. Majoritatea publicațiilor disponibile sunt despre organismul 25

Figura 5. Răspunsul la stres termic de drojdie (după Trott A. și Morano K.A., 2003) Trehaloza este utilizată în principal de celula de drojdie ca sursă de carbohidrați de rezervă și se găsește și în spori ca sursă de carbon ușor de utilizat. În faza logaritmică, cantitatea de trehaloză din celule este foarte mică, dar sub stres termic crește exponențial (Thevelein și Hofmann, 1995). Trehaloza exercită un efect protector asupra proteinelor prin blocarea agregării proteinelor induse de căldură și inhibarea modificărilor în structura proteinelor de care se leagă. În plus, glutationul (GSH, γ-glutamilcisteinilglicina) ca moleculă antioxidantă, neutralizantă a radicalilor liberi, este implicată și în protecția împotriva stresului termic. Prin operarea rapidă și coordonată a acestor procese, celula este capabilă să supraviețuiască stresului cauzat de șocul termic. 28

3. MATERIALE ȘI METODE 3.1. Cultura și menținerea tulpinilor Kluyveromyces marxianus CBS712 (NCYC 2791) și E1 mutante K. marxianus CBS712 au fost achiziționate de la tulpina NCYC (Colecția Națională a Culturii Drojdiei). Mutantul K. marxianus E1 a fost generat din tulpina CBS712 din Figura 3.2. așa cum este descris în acest capitol. Tulpinile au fost cultivate pe agar YPD și YM la 30 C pentru muncă practică zilnică. Compoziția mediului YPD: 1% extract de drojdie (BBLTM), 2% peptonă (Difco), 2% glucoză, 2% agar. Compoziția mediului YM: 0,3% extract de drojdie (BBLTM), 0,3% extract de malț, 0,5% peptonă (Difco), 1% glucoză, 2% agar. PH-ul ambelor medii YPD și YM este de 5,5. Tulpinile au fost depozitate în colecția de stoc în mediu YM suplimentat cu 20% glicerol la -70 ° C. 3.2. Generarea și identificarea mutantului termotolerant K. marxianus E1 100 colonii individuale ale tulpinii K. marxianus CBS712 au fost inoculate din mediul de agar YPD în 5 ml mediu YPD și incubate la 48 C cu o frecvență de agitare de 3 Hz timp de 2 zile. Culturile care au prezentat creștere au fost însămânțate în mediu proaspăt YPD și incubate în aceleași condiții (48 C, 3 Hz) și timp de 2 zile. Această altoire 29

3.11.5.2. Probele de proteine SDS-PAGE au fost tratate termic cu tampon de reducere a probei (5 minute, baie de apă 100 ° C) înainte de încărcare pe gelul SDS. Compoziția tamponului de reducere a probei: 10% (g/v) glicerol, 2% (g/v) tampon TRIS/HCI (0,5 mol l -1, pH 6,8), 2,5% (g/v) soluție albastru de bromofenol, 5% (w/v) mercaptoetanol. Am folosit un gel de poliacrilamidă de 12,5% (g/v) (Laemmli, 1970) și un Mini-PROTEAN II (Bio-Rad, SUA) pentru a separa proteinele. Compoziția gelului principal (12,5%): 4,2 ml soluție de acrilamidă 30% (greutate/volum), 2,5 ml tampon TRIS/HCI (1,5 mol l -1, pH 8,8), 0,1 ml de 10% (greutate/volum) ) Soluție SDS, 3,02 ml apă distilată, 5 pl TEMED, 50 pl 10% (g/v) APS. Componentele gelului de colectare (5%): 0,44 ml soluție de acrilamidă 30% (greutate/volum), 0,83 ml tampon TRIS/HCI (0,5 mol l -1, pH 6,8), 33 pl 10% (greutate/volum) v) Soluție SDS, 2,03 ml apă distilată, 2 pl TEMED, 16,7 pl 10% (greutate/volum) APS. 36

Compoziția tamponului rezervorului: 1,5% (g/v) TRIS, 0,5% (g/v) SDS, 7,2% (g/v) glicină (ph 8,3). Pentru a determina greutatea moleculară a proteinei, am folosit Page Ruler Protein Standards (MBI Fermentas, Germania). Când proba a fost în gelul de colectare, a fost utilizată o tensiune de 200 V, iar când a fost deja în gelul principal, a fost utilizată o tensiune de 200 V pentru a separa proteinele din probă. După electroforeză, benzile de proteine au fost vizualizate prin colorare Coomassie Brillant Blue. 3.12. Metode statistice 3.12.1 Metode statistice generale Pentru analize statistice, media a 3-5 măsurători independente și abaterile standard ale acestora au fost determinate în fiecare caz. Pentru a examina semnificația, s-a folosit testul t Student, unde p