Creșterea solubilității peptidelor biologic active cu derivați de oligoetilen glicol

Creșterea solubilității peptidelor biologic active cu derivați de oligoetilen glicol Disertație doctorală Ádám Bartos Supervizori: Dr. Katalin Uray Dr. Ferenc Hudecz MTA-ELTE Grup de cercetare chimie peptidică ELTE Departamentul de chimie organică ELTE-TTK Școala doctorală de chimie Șef: Inzelt Györ Chimie sintetică, știința materialelor, programul de chimie biomoleculară Conducător de program: István Tamás Horváth, D.Sc. 2008. 1

Mulțumiri Aș vrea să mulțumesc: dr. Miklós Hollósi, dr. András Perczel, șeful departamentului, pentru că mi-a permis să lucrez la Departamentul de chimie organică, Universitatea Eötvös Loránd, conducătorii mei, dr. Ferenc Hudecz, consilier științific, șef al grupului MTA Peptide Chemistry și dr. Uray Dr. Hedvig Medzihradszky și dr. Szilvia Bősze pentru studii analitice, dr. Gitta Schlosser pentru cercetarea identificării peptidelor prin spectrometrie de masă, Kata Horváti pentru spectrometrie de masă și către Farkas Viktor și dr. László Kocsis pentru sfaturi și sprijin utile Aș dori să mulțumesc Școlii Doctorale a Universității Eötvös Loránd pentru că mi-a făcut posibilă activitatea de doctorat, iar următoarele resurse financiare mi-au făcut posibil să-mi desfășor activitatea de doctorat: TKA o K61518 GVP-3.1 .1.-2004- 05-0183/3.0 GVP-3 .2.1-2004-04-0005/3.0. Mulțumesc părinților mei, familiei mele, Rita, pentru răbdarea lor și fondul calm pe care m-au ajutat de-a lungul activității mele de doctorat. 2

Lista abrevierilor Am folosit abrevierile de 1 și 3 litere utilizate în literatura de specialitate pentru abrevierea aminoacizilor (1). AAA AUC Boc BP Bzl CoA CM Zona de analiză a aminoacizilor sub curbă t-butiloxicarbonil benzotriazol-1-iloxitru (dimetilamino) fosfoniu hexafluorofosfat benzil coenzimă un mediu total CP HC (Acm) VVVDVSHEDP-H 2 DCcimic diciclohexiluree DIC, -diizopropilcarbodiimidă DIEA, -diizopropiletilamină DMAP 4-dimetilaminopiridină DMF, -dimetilformamidă DMS dimetilsulfoxid DMS dimetil sulfoxid ED H-EVV -diamină EDT 1,2-etaneditoliol Etanoză spectrometrie Fc fragment cristalizabil, constantă de anticorp, regiune constantă Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonil 3

Fmoc-su HF HBt HPcp HPLC IC 50 ICM IgG MBHA MS MeH MTT HS MP Pcp PBMC PEG PyBP tbu TEG TFA TFMSA TTD TTD-Su 9-fluorenilmetoxicarbonil - oxisuccinimidă fluorură de hidrogen 1-hidroxibenztriazol Concentrație lichidă Cromatografie performanță mediu fără ser 50% inhibare imunoglobulina G 4-metilbenzidrilaminică spectrometrie de masa de rășină metanol 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazoliu hydroxysuccinimidonepyrrolidinimethylpyrimidylpyrimidylpyrimidylpyrimidylpyrimidylpyrimyrimethylpyrimidylpyrimidylpyrimidylpyrimidone ester mononucleare de sânge periferic Cell periferic mononuclear polietilen glicol celular benzotriazol-1 -acid trifluoracetic acid trifluoracetic-3,6,9-trioxaundecan-1,11-dicarboxilic acid trifluoroacetic acid trifluorometansulfonic 4,7,10 amino-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanamida acid succinic V-HP-VVD -H 2 Z benziloxicarbonil 4

Cuprins 1. Introducere 8 2. Revizuirea literaturii 10 2.1. Poli și oligoetilen glicoli 10 2.2. Interacțiunea și utilizarea avidinei cu biotina 12 2.3. Proteine imunoglobulinei G 15 2.4. Sinteza peptidelor în fază solidă 17 2.4.1. Prezentare istorică 17 2.4.2. Rășini 19 2.4.3. Structura lanțului peptidic 21 2.4.4. Grupuri de protecție a lanțului lateral 22 2.4.5. Metode de formare a legăturii peptidice 23 2.4.6. Urmărirea conexiunilor 25 2.4.7. Scindarea peptidelor din rășină 26 2.4.8. Purificarea și identificarea peptidelor 27 3. Obiectiv și strategie 28 4. Rezultate 31 4.1. Rezultatele sintezei peptidelor CP și VP 31 4.2. Rezultate ale sintezei peptidelor ED 34 4,3 derivați de ligoetilen glicol 35 4.3,1 Distanțieri pe bază de acid 3,6,9-trioxaundecan-1,11-dicarboxilic (TEG) 36 4.3.1.1. Oxidarea tetraetilenglicolului 37 4.3.1.2 Oxidarea în fază heterogenă a tetraetilenglicolului 37 4.3.1.3. Protecție asimetrică a acidului 3,6,9-trioxaundecan-1,11-dicarboxilic (TEG) 38 4.3.1.4. Prepararea mono-Boc etilendiaminei (Boc-EDA) și a mono-fmoc etilendiaminei (Fmoc-EDA) 40 4.3.1.5. Sinteza distanțierilor protejați pe bază de EDA-TEG în soluția 41 4.3.2. Distanțieri pe bază de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamină (TTD) 42 4.3.2.1. Crearea unei structuri ionice duble 43 4.3.2.2. Dezvoltarea protecției Boc și Fmoc pe distanțierul TTD-Su 45 4.3.2.3. Formarea esterului activ 46 4.3.2.4. Conectarea distanțierelor bazate pe TTD 47 5

6.4.2.3. Conjugarea biotinei-EDA-TEG cu peptida ED 86 6.4.2.4. Prepararea conjugatului biotină-EDA-TEG-ED folosind Fmoc-EDA-TEG 86 6.4.3. Conjugate biotinilate pe bază de TTD 87 6.4.3.1. Pregătirea biotinei-TTD-Su în soluția 87 6.4.3.2 . Sinteza biotinei (TTD-Su) n (n = 1,2,3) pe fază solidă cu strategia Boc 88 6.4.3.3. Sinteza biotinei (TTD-Su) n (n = 1,2,3) pe fază solidă prin strategia Fmoc 89 6.4.3.4. Conjugarea biotinei (TTD-Su) n (n = 1,2,3) la peptidele CP și VP 90 6.4.3.5. Structura biotinei (TTD-Su) n (n = 1,2,3) pe peptidele CP și VP prin strategia Fmoc 90 6.4.3.6. Structura biotinei (TTD-Su) n (n = 1,2,3) pe peptidele CP și VP prin strategia Boc 91 6.5. Metode analitice 92 6.5.1. Monitorizarea reacțiilor de cuplare și clivaj 92 6.5.2. Analiza HPLC 93 6.5.3. Analiza aminoacizilor 94 6.5.4. Spectrometrie de masă 94 6.6. teste de solubilitate 95 6.6.1. Măsurarea solubilității prin HPLC 95 6.6.2. Măsurarea lizibilității prin măsurarea masei 96 6.7. Studii de citotoxicitate 97 6.7.1. Pregătirea PBMC 97 6.7.2. Determinarea citotoxicității distanțierului utilizând testul colorimetric tetrazolium (MTT) 97 7. Referințe 99 Rezumat 104 Rezumat 105 7

Teza mea de doctorat constă în sinteza peptidelor, prepararea distanțierilor hidrofili și sinteza conjugatelor care conțin biotină și investigarea acestora. În acest scop, am pregătit o secvență hidrofobă de IgG umană și o versiune mai scurtă a acesteia, ale cărei forme biotinilate sunt utilizate în testele ELISA (6). Au fost folosiți doi oligoetilen glicoli ca materii prime pentru prepararea distanțierilor hidrofili, unul pe bază de acid dicarboxilic (acid 3,6,9-trioxaundecan-1,11-dicarboxilic, TEG) și unul pe bază de diamină (4,7,10- trioxa-1,13-tridecanediamină, TTD). oligoetilenglicol Inserarea distanțierilor oligoetilenglicol între biotină și peptidă crește solubilitatea conjugatului. Solubilitatea conjugatelor preparate a fost testată prin două metode. De asemenea, am examinat dacă distanțierul creat are un efect citotoxic, deoarece acesta este un aspect important pentru aplicabilitatea sa ulterioară (de exemplu, dizolvarea medicamentelor). 9

Avidina este o componentă glicoproteică a albușului de ou, 0,05% din conținutul total de proteine. Homotetramerul, cântărind 66 kda, poate lega până la 4 biotine. Biotina este legată ireversibil, împiedicând astfel biotina să fie absorbită în tractul gastro-intestinal. consumul a mai mult de 20 de bucăți de albușuri de ou pe zi provoacă simptome de carență. Prin denaturare, își pierde capacitatea de a lega biotina. Interacțiunea dintre avidină și biotină (Fig. 3) (KD = 1,3x10-15 M) este cea mai puternică interacțiune non-covalentă cunoscută în sistemele biologice până în prezent, rezistând valorilor extreme ale ph, proteazei și unele procese de denaturare (18) . Figura 3: Aminoacizi implicați în interacțiunea avidină-biotină 13

Interacțiunea avidină-biotină a fost folosită pentru prima dată de Heitzmann și Richards pentru citochimia afinității (19). În 1976, Bayer, Wilchek și Skutelsky au folosit anticorpi biotinilați pentru localizarea receptorilor, precum și a antigenelor biotinilate pe membranele eritrocitelor (20). Multe metode de legare biologică se bazează pe studiul legării receptorului peptidic sau a legării anticorpilor peptidici. În acest scop, peptida care urmează a fi testată este adesea marcată cu biotină (21, 22), care este legată de o placă filmată cu streptavidină. Această metodă are două dezavantaje. Una este că biotina se leagă direct de peptidă, ceea ce poate interfera cu testele de legare. În acest caz, se utilizează un derivat de biotină cu lanț mai lung, precum acidul biotinil-6-aminohexanoic (Figura 4). Un alt dezavantaj al acestei metode este că este dificil de aplicat peptidelor care nu sunt sau slab solubile în apă, deoarece cuplarea biotinei la peptidă reduce și mai mult solubilitatea în apă, iar studiile au loc într-un mediu hidrofil. Solubilitatea biotinei în apă este de 0,22 mg/ml și în alcool etilic 95% 0,80 mg/ml. H H S H H Figura 4: Acid biotinil-6-aminohexanoic 14

moleculă pentru legarea la receptorii Fc din diferite celule, rezultând, de exemplu, activarea celulelor B. Sondermann și colab. (23) au folosit difracția cu raze X pentru a determina ce părți din regiunea Fc a IgG sunt implicate în legarea receptorilor Fc. Cercetarea comună a grupului nostru de cercetare și a Departamentului de Imunologie de la Universitatea Eötvös Loránd a confirmat parțial rolul acestor segmente de peptide în legare (6). 16

H Polimer rășină Wang Fmoc le Rink-amidă-rășină MBHA Polimer Cl Polimer rășină Merrifield H 2 rășină MBHA Polimer Figura 5: Structura substraturilor utilizate 20

R-CH + ipr- = c = -ipr DCM/DMF ipr-h R ipr H DCM/DMF R + ipr-h H-iPr H 2 -R 'DCM/DMF R HR' Figura 6: Mecanism de comutare DIC/HBt RC - HDIEA + + (Me 2) 3 P + PF- 6 DCM/DMF RCP - - (Me 2) 3 PF 6 - HRH 2 -R 'DCM/DMF R HR' Figura 7: Mecanism de comutare BP/HBt 24

1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 A 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0-0,2 0 10 20 30 40 timp (minute) Figura 10: Cu strategia Boc Cromatograma analitică RP-HPLC a peptidei VP brute preparată 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 A 0,2 0,1 0,0-0,1 -0,2 0 10 20 30 40 timp (min) Figura 11: Cromatograma analitică RP-HPLC a peptidei CP brute preparată prin strategia Boc 32

1,4 1,2 1,0 0,8 A 0,6 0,4 0,2 0,0-0,2 0 10 20 30 40 timp (minute) Figura 12: Cromatograma analitică RP-HPLC a peptidei VP brute preparată prin strategia Fmoc 0,8 0,7 0,6 0,5 A 0, 4 0,3 0,2 0,1 0,0-0,1 0 10 20 30 40 timp (min) Figura 13: Cromatograma analitică RP-HPLC a peptidei CP brute preparată prin strategia Fmoc 33