Investigarea secreției ionice de către celulele epiteliale

Investigația secreției ionice a celulelor epiteliale Disertație doctorală Universitatea Demeter Irma Semmelweis Școala doctorală de medicină clinică Supervizor: Dr. Gábor Varga Profesor, doctor al Academiei Maghiare de Științe Judecători oficiali: Dr. Beáta Sperlágh, Doctor al Academiei Maghiare de Științe Dr. Valáta Kecskeméti Membrii comisiei de examinare: Dr. Zoltán Vincze, Dr. György Simon, doctor al Academiei Maghiare de Științe, candidat la medicină Dr. Péter Hegyi, dr. D. Budapesta 2009

CUPRINS CUPRINS CUPRINS. 2 LISTA ABREVIERILOR. 4 Glandele salivare. 9 Secreția de proteine. 11 Mecanismul secreției de fluide și ioni. 12 Reglarea secreției. 15 Pancreasul. 18 Mecanismul secreției de proteine. 19 Secreția de fluide și electroliți. 19 Reglarea secreției. 24 OBIECTIVE. 27 MATERIALE ȘI METODE. 28 Linii celulare utilizate. 28 Materiale. 29 Conținutul soluțiilor. 29 Metode. 30 Întreținerea culturii celulare, pregătirea pentru măsurare. 30 Plantare. 30 Biologie moleculară. 31 Măsurarea curentului de scurtcircuit. 32 Microfluorometrie. 32 Statistici. 34 REZULTATE. 35 Investigarea secreției ionice de către celulele Par-C10. 35 Recidiva ph intracelulară din acidoză. 37 Investigarea secreției de HCO 3. 40 Investigarea prezenței schimbătorilor de anioni. 42 Investigarea mecanismelor care reglementează nivelurile intracelulare de Ca 2+ ale celulelor Par-C10. 44 2

Cuprins Investigarea mecanismelor implicate în secreția ionică a liniei celulare HPAF din canalul pancreatic. 50 Efectul ATP asupra secreției. 50 Compensare pentru acidoză. 52 Efectul inhibitorilor. 54 Secreție transepitelială HCO 3. 58 DISCUȚIE. 60 Examinarea celulelor derivate din acot parotid de șobolan. 60 Investigarea secreției ionice de către celulele Par-C10. Studiu de eliminare a Ca 2+ a celulelor Par-C10 derivate din parotide de șobolan. 63 Investigarea secreției ionice dintr-o linie celulară derivată dintr-un canal pancreatic. 66 CONCLUZII. 69 REZUMAT EXECUTIV. 71 REZUMAT. 72 BIBLIOGRAFIE. 73 LISTA PUBLICAȚIILOR. 84 MULȚUMIRI. 85 3

Abrevieri LISTA ABREVIERILOR ACh acetilcolină ADP adenozin difosfat AE schimbător de anioni Ag argint AgCl clorură de argint AQP acvaporină, canal de apă ATCC American Type Cell Culture Collection ATP adenozină-5-trifosfat -ECECb-AM 2,7 5- (și-6) -Carboxifluoresceină ester acetoximetilic CEL MAI BUN canal ionic de tip Bestrophin Br ion bromură BzATP 3-O- (4-benzoil) benzoil-ATP CA anhidrază carbonică Ca 2+ ion de calciu [Ca 2+] i concentrație intracelulară de ion de calciu CaCl 2 clorură de calciu camp adenozil monofosfat ciclic Capan-1 denumire linie celulară CCh carbachol, carbamilcolină CCK colecistochinină cdns copie acid dezoxiribonucleic Denumire linie celulară CFPAC-1 fibroză chistică regulator de conductivitate transmembranar CFTR inh -172 CFTR gTR Clorură de ion CLC Clorură de ion canal CLCA Clorură de ion activată cu calciu Canal de ion CO 2 dioxid de carbon 4

Abrevieri Acid ciclopiazonic CPA DAG diacilglicerol DMEM/F12 Amestec de mediu Eagle modificat de Dulbecco și amestec nutritiv Ham F12 DNDS Acid 4,4-dinitrostilbenzen-2,2-disulfonic E3KARP sodiu schimbător de hidrogen subtip 3 kinază A-acid tetraacetic EGF factor de creștere epidermic EGTA glicol tetraacetat EIPA 5- (N-etil-N-izopropil) amiloridă ENaC epitelial canal ionic sodic ER reticul endoplasmatic EtBr bromură de etidiu FBS ser de vițel fetal FGF factor de creștere fibroblast GRGF factor de creștere fibroblast 4-diizotiocianatodihidrostilbene-2,2 Receptorul histaminei R subtip 2 cea mai bună proteină bestrofină umană HCO 3 ion bicarbonat HEPES Acid 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanesulfonic HOE-694 3-metilsulfonil-4-piperidinobenzoil guanidină HPAF denumirea unei linii celulare izolate din adenocarcinomul pancreatic uman în IK canal ionic de potasiu IP 3 inozitol trisfosfat IRBIT - împreună cu IP 3 eliberat IP 3-receptor de legare a proteinelor I SC curent de scurtcircuit K + ion de potasiu KCl clorură de potasiu KCC clorură de potasiu cotransportor 5

Abrevieri KCNK K subfamilia canalelor de potasiu KCNMA conductivitate înaltă canal ion ion potasiu activat cu ion calciu M subfamilie KCNN conductivitate medie canal ion ion potasiu activat cu ion calciu N subfamilie Kschanthane transportor ionic înalt KbN izolat din rinichi bicarbonat sodic bicarbonat sodic conductiv Ca 2 + -activat K + familie de canale MEM Mediu esențial minim Mg 2+ ion magneziu Mg-ATP magneziu adenozină trisfosfat MgCl clorură de magneziu mrns mesager, mesager ARN MSD regiune de permeație a membranei Na + ion de sodiu NaH sodiu -bicarbonat NANC non-adrenergic non-colinergic Cotransportor bicarbonat de sodiu NBCn1 Cotransportor bicarbonat de sodiu NBCn1 subtip 1 Regiune de legare nucleotidică NBD Schimb de calciu sodic NEAA aminoacizi neesențiali NGF factor de creștere neurogen NH 4 + - amni Cl Clorură de amoniu NHE Schimb de hidrogen de sodiu NHERF Schimb de hidrogen de sodiu factor de reglare NK neurokinină NKCC sodiu potasiu-2 clorură cotransportor NMDG + ion N-metil-D-glucamină 6

Abrevieri NO oxid nitric NO 3 ion nitrat NSF Factor sensibil la N-etilaleimidă O 2 oxigen PACAP pituitară adenilil ciclază activând peptida Par-C10 este un parotid de șobolan acinar denumire linie transportator de anioni putativ PBS fosfat tampon PCR polimerază reacție în lanț PDZ glicină-glicină -fenilalanină secvență de aminoacizi ph i intracelular ph PKA protein kinase PKC protein kinase-c PLCβ phospholipase Cβ Calcium ion ATPase in PMCA plasma membrane pnbc pancreatic identified sodium bicarbonate cotransporter tirosine peptide-PP pancreatic polypeptide P-pancreatic polypeptide family name numele familiei receptorului purinergic Regiunea de reglare a domeniului RNA acid ribonucleic RT-PCR transcriptază inversă polimerază reacție în lanț Receptor RyR ryanodină Eroare standard SEM, deviație standard SK conductiv mediu ion de calciu activat ion canal de ion potasiu SLC solut transportator de înaltă conductivitate ion de calciu activat canal de ioni de potasiu SNAP NSF proteina de legare SNARE SNAP receptor STE ATP-legare transportor exprimat în drojdie 7

Abrevieri TASK TWIK (canal K + slab spre interior cu doi pori) canal K + sensibil la acid TER rezistență transeitelială rezistență t-capcană asociată țintă SNARE UTP uridină trifosfat VAMP proteină de membrană asociată veziculelor VIP proteină vasoactivă intestinală V m diferență de potențial v-capcană asociate veziculelor SNARE 2MeSADP 2-metiltio-ADP 5-HT 5-hidroxitriptamină, serotonină 8

Introducere În vârful piramidei sunt multe granule secretoare mature sau mature din care conținutul proteic stocat este eliberat prin exocitoză. Figura 1: Localizarea glandelor salivare la om. (sursă: http://3.bp.blogspot.com) Figura 2: Structura celulară a glandei salivare. (sursă: http://www.nanomedicine.com) 10

Introducerea este cel mai cunoscut membru al familiei la nivel molecular (9, 11, 12). Imunohistochimia a relevat, de asemenea, cotransportorul 1 de clorură de potasiu (KCC1) din familia SLC12A din membrana basolaterală a celulelor acinare ale glandei salivare, dar rolul său nu este încă cunoscut (9). Captarea Cl este activată de interacțiunea schimbătorului Na +/H + (NHE) și a schimbătorului HCO 3/Cl din membrana basolaterală. Odată cu eliberarea H + și HCO3, Na + și Cl sunt preluate (8, 9). Este probabil ca izoforma NHE1, care se găsește în toate celulele și joacă un rol important în menținerea pH-ului celular, să îndeplinească această funcție (9). În plus, s-au identificat forme de NHE2, NHE3 și NHE4 în acinusul glandei salivare, dintre care NHE2 și NHE3 sunt exprimate în membrana apicală, iar funcția NHE4 nu este încă cunoscută (9). Dintre schimbătorii de anioni, izoformele AE2 și AE4 aparținând familiei SLC4 au fost detectate pe latura basolaterală a acinelor parotide umane și de șobolan (9, 10). AE2 este exprimat în aproape toate tipurile de țesuturi (13), în timp ce AE4 este probabil să apară doar în membrana basolaterală a conductelor glandei salivare (14), deci nu are niciun rol în secreția anionică. Figura 3: Sistem transportor Acinus al glandei salivare. 13

Introducere Schimbatoarele Cl/HCO3 și Na +/H + (probabil NHE3) (9) se găsesc și în membrana apicală a celulelor canalelor (31). Pe partea bazolaterală, s-a detectat expresia canalului de clorură și a schimbătorului de Na +/H + (NHE2) (9) (31) (Fig. 4). Nu există canale de apă în celulele conductelor, astfel încât acestea să nu absoarbă apa, saliva devine hiposmotică și alcalină. Pe măsură ce producția de salivă crește, compoziția ionică a salivei devine din ce în ce mai asemănătoare cu cea a plasmei. Acest fenomen se datorează faptului că ducturile sunt mai puțin capabile să schimbe compoziția salivei primare care trece rapid prin conducte decât în repaus. Figura 4: Schema model a sistemului de transport ionic al conductei glandei salivare. Reglarea secreției Salivarea este reglementată exclusiv de sistemul nervos autonom, a cărui intensitate este determinată de secreția celulelor acinare. Deoarece canalele absorb ionii din saliva primară, mai degrabă decât îi secretă și sunt incapabili să transporte apă, ei nu pot modifica cantitatea de salivă. În membrana basolaterală a celulelor acinare 15

Introducere Secreția canalelor este, de asemenea, stimulată de ATP și adenozină la receptorii apicali din secreția acinelor (65). Un număr de receptori P2 au fost detectați pe suprafața lor, inclusiv receptori P2Y 2, P2Y 4, P2X 4 și P2X 7. ATP interstițial din terminații nervoase, celule insulare, transportori basolaterali sau scurgeri de acine, probabil prin receptorul P2Y 2 sau P2Y 4, inhibă funcția canalului K + basolateral și, prin aceasta, secreția anionică (33). Pe partea apicală, este probabil ca receptorii P2X să fie exprimați. Stimularea lor este incapabilă să inițieze procese secretorii, dar îmbunătățește secreția de ioni indusă de secretină (33). Acumularea și secreția de ATP de către acinele din granule și expresia receptorilor specifici membranei observate în conducte sugerează că ATP poate fi un mesager al fluxului de informații între acine și conducte (33). 26

Obiective OBIECTIVE În studiile noastre, am căutat să răspundem la următoarele întrebări: 1. Dacă există secreție transepitelială de HCO 3 în linia celulară parotidă acinară Par-C10 și, dacă da, ce mecanisme o ajută. 2. Ce mecanisme reglează nivelurile intracelulare de Ca 2+ în celulele Par-C10. 3. Dacă și prin ce mijloace, transportul transepitelial de HCO 3 are loc într-o linie celulară derivată din adenocarcinomul pancreatic uman HPAF care nu conține CFTR funcțional. 27

Materiale și metode Metode Întreținerea și pregătirea culturii celulare pentru măsurare Liniile celulare au fost cultivate în toate cazurile în aer umidificat la 37ºC îmbogățit cu 5% CO 2 într-un dulap de cultură. HPAF Celulele au fost derivate din ATCC. Au fost suplimentate cu MEM conținând L-glutamină și NEAA, Na-piruvat, 10% FBS, 100 UI/ml penicilină și 1 μg/ml streptomicină. Celulele erau trecute 1:10 săptămânal. Par-C10 Celulele parotide de șobolan Par-C10 au fost o donație generoasă de la Dr. David Quissel (Școala de Medicină Dentară, Universitatea din Colorado Health Sciences Center, Denver). Celulele au fost cultivate în mediu DMEM/F-12 1: 1 suplimentat cu 10% ser fetal de vițel, 0,1 μm acid retinoic, 2 nm triiodotironină, 0,4 μg/ml hidrocortizon și 100 UI/ml penicilină, s-a adăugat 1 μg/ml streptomicină . Celulele erau trecute 1:50 pe săptămână. Celulele de transplant au fost însămânțate pe suprafața unei membrane de poliester (Costar, Transwell-CLEAR) cu un număr de celule de 500k. Au fost incubate în mediu în condiții sterile. Mediul a fost schimbat la fiecare 2 zile. Formarea monostratului confluent a fost monitorizată prin măsurarea regulată a rezistenței transmembranare (TER). Experimentele au fost efectuate după 10-12 zile, când rezistența a atins 1000/cm2 pentru celulele HPAF și 3000/cm2 pentru celulele Par-C10. 30