Test avansat LightCycler MRSA pentru utilizare cu instrumentul LightCycler 2.0

Recomandați documente

Test avansat LightCycler® MRSA pentru utilizare cu instrumentul LightCycler® 2.0 PENTRU UTILIZAREA DIAGNOSTICĂ ÎN VITRO. ®

LightCycler MRSA Advanced Test ®

Kitul LightCycler Advanced Lysis

P/N: 05352894 190

P/N: 05205743 190

LightCycler MRSA Advanced Test este un test calitativ de diagnostic in vitro pentru detectarea directă a colonizării nazale a Staphylococcus aureus rezistent la meticilină (MRSA) pentru prevenirea și controlul infecțiilor cu MRSA în instituțiile medicale. ® Testul se efectuează cu dispozitivul LightCycler 2.0 de la probe de tampon nazal de la pacienți la care se suspectează colonizarea; pregătirea probei se realizează prin extracție cu tampon și întrerupere mecanică, urmată de amplificarea ADN-ului MRSA prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) și detectarea ADN-ului amplificat prin sonde de hibridizare fluorescente specifice țintei. ®

PRINCIPIILE PROCEDURII

Detectarea MRSA utilizând LightCycler MRSA Advanced Test se bazează pe 3 proceduri principale: •

Pregătirea probelor prin digestia mecanică a peretelui celular bacterian

Amplificarea PCR și detectarea ADN-ului țintă de către sonde de hibridizare specifice

Generarea automată a unui rezultat la analiza curbei de topire

Specimenele de tampon nazal sunt explorate mecanic folosind LightCycler Advanced Lysis Kit și MagNA Lyser. Capetele tamponului tăiat în tuburile de liză trebuie încălzite pentru a inactiva bacteriile. Tuburile de liză sunt apoi transferate în MagNA Lyser, unde se formează lizat brut în timpul distrugerii mecanice a peretelui celular bacterian. După o scurtă centrifugare a mărgelelor de sticlă și a fibrelor de tampon ®, proba prelucrată este analizată prin PCR folosind un LightCycler MRSA Advanced Test. Selecția secvenței țintă a amplificării PCR Primerii și sondele LightCycler® MRSA Advanced Test detectează o secvență caracteristică care indică încorporarea ADN-ului MRSA în cromozomul S. aureus al casetei SCCmec. Amplificare ®

La finalizarea procedurii PCR în timp real, instrumentul LightCycler 2.0 efectuează automat analiza curbei de topire. Ampliconii ADN monocatenari legați de sonda de hibridizare sunt expuși la temperaturi în creștere. Când produsul PCR atinge o anumită temperatură, una dintre cele două sonde de hibridizare legate se topește, rezultând întreruperea semnalului fluorescent. Scăderea semnalului fluorescent are loc la o anumită temperatură și acest lucru are ca rezultat topirea vârfurilor care permit detectarea și diferențierea ampliconilor specifici pentru MRSA și IC. Generarea automată a rezultatului în timpul analizei curbei de topire ®

După identificarea vizuală a vârfurilor de topire în benzile TMC ale software-ului LightCycler, rezultatele testelor sunt transmise instrumentului de evaluare desemnat (software Micro Analysis) și se generează un raport.

LightCycler Advanced Lysis Kit ® LightCycler Advanced Lysis Kit (P/N: 05205743 190)

LYS (reactiv distructiv) tampon Tris apăsând butonul EDTA.

Notă: Nu scoateți CD-ul software-ului LightCycler MRSA Advanced în timpul repornirii. 5.

După repornire, urmați instrucțiunile din expertul de instalare. Apăsați butonul pentru a porni instalarea MAS.

Selectați opțiunea dacă un singur utilizator va lucra pe unitatea de control LightCycler sau opțiunea dacă mai mulți utilizatori vor lucra ® pe unitatea de control LightCycler.

Confirmați instalarea cu succes a MAS făcând clic pe butonul din fereastră.

Rulați aplicația utilizând pictograma MAS de pe desktopul computerului.

Dosar de date pentru fișierele * .ixo și * .pdf: creat automat la pornirea MAS.

Confirmați instalarea software-ului Micro Analysis (MAS)

Copiați fișierele cadru (LightCycler MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.ixo și LightCycler ® MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.pdf sau o versiune ulterioară) din CD-ul LightCycler MRSA Advanced Software v1.0 (sau o versiune ulterioară) CE în folder.

Dacă MAS nu este deja deschis, faceți dublu clic pe pictograma MAS de pe desktop și apăsați.

Selectați MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.ixo (sau o versiune ulterioară) din folder.

Apăsați butonul pentru a indica faptul că raportul LightCycler nu include indicatorul.

Introduceți numărul lotului, data de expirare și datele de laborator în câmpurile corespunzătoare din fereastra MRSA Configuration Settings.

Set de liză avansată Lot nr

MRSA Advanced Test Lot nr

Informații despre laboratorul de informații personale

Selectați tipul de raport și confirmați cu. Programul analizează automat fișierul și afișează datele.

Imprimați raportul.

Deschideți și tipăriți fișierul MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.pdf (sau o versiune ulterioară) (aflat în dosar).

Asigurați-vă că raportul MAS tipărit și PDF-ul tipărit conțin aceleași rezultate. Dacă nu, contactați centrul de service local Roche pentru asistență tehnică.

Dezinstalarea software-ului Micro Analysis (MAS)

Conectați-vă ca administrator pe unitatea de control LightCycler.

Apăsați butonul de pe tava unității de control LightCycler.

Apare o listă a programelor instalate în prezent, faceți clic aici.

Selectați opțiunea și confirmați apăsând butonul.

Notă: CD-ul MSS include o funcție de eliminare și reparare. Funcția de eliminare poate fi utilizată și pentru procedura descrisă. Funcția de reparare poate fi utilizată pentru a recupera fișierele corupte sau lipsă din software-ul Micro Analysis. ®

Instalarea macrocomenzilor LightCycler MRSA Advanced

Instalați macrocomenzi * .lckit: LightCycler MRSA Advanced MCC Macro v1.0 (MRSA ® MCC_04484355001A_1.0.Ickit) sau o versiune superioară și LightCycler MRSA Advanced Macro v1.0 ® CE (MRSA_05352894190_1.0. Ickit) sau o versiune superioară de la LightCycler MRSA Advanced v 1.0 (sau mai mare) CE CD.

Vă rugăm să consultați secțiunea „Executarea macro-ului LightCycler”.

Procedură de compensare a culorilor utilizând ® LightCycler Set de compensare multicolor pentru utilizare cu LightCycler 2.0

2.0 Manual de utilizare „Roche

Urmați acești pași pentru a crea un nou fișier de compensare a culorii sau pentru a înlocui unul de expirare. 1.

Topiți tuburile 1, 2, 3 și 5, amestecați ușor și rotiți scurt.

Pentru a dilua conținutul tubului 2 de 3 ori, amestecați:

10 pl de soluție în tubul 2

20 µl de tampon din tubul LYS fără transfer de margele de sticlă ®

Pipetați 10 µl din fiecare componentă în capilarele separate ale LightCycler (20 µl).

Capilarul 1: Tubul 1

Capilarul 2: etapa de diluare E2

Capilarul 3: Tubul 3

Capilarul 4: Tubul 5

Notă: Aruncați conținutul diluat al tubului 2 la sfârșitul cursei. 4.

Pipetați 10 µl de tampon din tubul LYS (fără transfer de margele de sticlă) în fiecare capilar pentru a obține un volum total de 20 µl.

Folosiți dispozitivul de acoperire pentru a închide capilarele cu un dop.

Centrifugați capilarele folosind LC Sample Disc Centrifuge 2.0 sau centrifugă standard și adaptoare pentru centrifugă. Tuburile trebuie să ocupe următoarele poziții în discul de probă: a.

Poziția 1 a probei de disc: CCB (tubul 1)

Eșantionul poziției 2 a discului: CC530 (tubul 2)

Poziția de probă 3: CC610 (tub 3)

Eșantionul poziției 4 a discului: CC670 (tubul 5)

Notă: Nu reduceți volumul din fiecare capilar. 7.

Transferați discul de probă LightCycler pe LightCycler 2.0. Dacă utilizați o centrifugă convențională ®, transferați capilarele pe discul de probă LightCycler așa cum este descris în pasul E6.

Notă: Nu modificați ordinea reactivilor de pe cadran. 8.

Porniți și salvați Experimentul de compensare a culorilor (CCE).

Pentru a utiliza macrocomanda MRSA Advanced, vă rugăm să consultați secțiunea „Executarea unei macro Roche” din Manualul de utilizare LightCycler® 2.0.

Salvați cursa cu un nume scurt, unic (de exemplu, MRSA_CCE_YYMMDD-xx, Y = an, H = lună, N = zi, xx = numărul de rulări).

Un raport este generat automat la finalizarea rulării.

Imprimați raportul.

Executare validare Raportul nu indică dacă MCC a avut succes (valid). Valabilitatea unei rulări MCC poate fi determinată numai în timpul primei rulări MRSA Advanced după executarea unui MCC. ®

Dacă raportul LightCycler Multicolor Compensation Set este semnalizat (de exemplu), rularea este nevalidă. Repetați alergarea.

Dacă setul de compensare multicolor LightCycler nu primește un semnal, treceți la pasul următor.

Notă: Dacă controlul negativ (NC) sau ® MRSA (+) C este în mod constant invalid în timpul testului avansat LightCycler MRSA, fișierul de compensare a culorii LightCycler poate fi defect. Repetați operația de compensare a culorii sau contactați centrul de service local Roche pentru asistență tehnică.

Creați un obiect de compensare a culorilor (CCO).

Activați modul de scanare Compensare culoare și apăsați butonul.

Creați un nume scurt, unic; pentru a fi identificat în mod clar de Micro Analysis Software (MAS), denumirea convențională a obiectului de compensare a culorii este: MRSA_CCO_YYYMMDD-xx (Y = an, H = lună, N = zi, xx = numărul de rulări).

Acest obiect este utilizat pentru a analiza în continuare testele efectuate folosind LightCycler MRSA Advanced Test.

Pregătirea probei și controlului.

Etichetați un tub cu șurub LYS în mod corespunzător pentru fiecare probă de pacient.

Notă: Nu marcați tuburile în partea superioară a capacului. 2.

Scoateți tamponul din containerul de transport.

Așezați un singur cap de tampon într-un tub LYS.

Țineți tamponul de mâner, aproape de marginea tubului, introduceți-l la câțiva milimetri de la partea inferioară a tubului și îndoiți mânerul până la marginea tubului până se rupe. De asemenea, puteți folosi foarfece pentru a tăia mânerul tamponului lângă marginea tubului. Ștergeți marginile foarfecelor între fiecare tampon cu o cârpă îmbibată în etanol 70% (sau Microzid).

Notă: Utilizați tifon pentru a minimiza riscul de contaminare atunci când rupeți tamponul. Folosiți tifon nou pentru fiecare tampon. 5.

Închideți bine capacul LYS.

Pregătirea controlului negativ

Notă: Reactivul NC trebuie să fie preparat în același timp cu probele de testat. 1.

Etichetați un tub cu șurub LYS în mod corespunzător pentru fiecare control negativ.

Notă: Nu marcați tuburile în partea superioară a capacului. 2.

Așezați un tampon steril în containerul de transport. Consultați secțiunea „Alte materiale necesare, dar care nu sunt furnizate” pentru o listă de tampoane recomandate.

Se incubează 1 minut la temperatura camerei.

Scoateți tamponul din containerul de transport.

Așezați un singur cap de tampon într-un tub LYS.

Notă: Utilizați tifon pentru a minimiza riscul de contaminare atunci când rupeți tamponul. Închideți bine capacul LYS.

Pregătirea probei și controlului

Probele de căldură și controlul negativ la 95 ± 2 ° C timp de 2 minute într-un bloc de încălzire uscat.

În MagNA Lyser, probele și controlul negativ sunt întrerupte timp de 70 de secunde la 5000 rpm. Consultați manualul de utilizare MagNA Lyser pentru detalii despre utilizare.

Probe de centrifugare și control negativ la temperatura camerei la 8000 - 20.000 x g timp de 1 minut.

Notă: Probele prelucrate pot fi depozitate la -15 până la -25 ° C timp de până la 30 de zile, la 2 până la 8 ° C timp de 6 zile și la 15 până la 25 ° C timp de 1 zi. Prepararea reactivului 1.

Decongelați reactivul MRSA RXNMX și MRSA DETMX și MRSA (+) C la temperatura camerei. Asigurați-vă că reactivii sunt complet dezghețați înainte de utilizare.

Agitați reactivii MRSA RXNMX și MRSA DETMX și MRSA (+) C timp de 3-5 secunde și centrifugați scurt într-o centrifugă pentru a colecta materialul de la baza tubului.

Pregătiți reactivul de lucru al amestecului principal într-un tub de microcentrifugă sterilă din silicon din polipropilenă pentru numărul adecvat de probe și controale de testat. (Utilizați Tabelul 1 pentru îndrumare.)

Notă: Volumele necesare includ 2 reacții ale controalelor negative și pozitive și un volum în exces, luând în considerare volumele moarte și pentru a facilita pipetarea de la tubul de amestecare la capilarele LC. Notă: Dacă este necesar, utilizați Microtube (VWR P/N 2017-688) sau echivalent pentru a facilita deschiderea MRSA RXNMX și MRSA DETMX.

Tabelul 1. Pregătirea reactivului de lucru Master Mix