Rolul genelor autofagice în reglarea morții neuronale, a dimensiunii celulelor și a procesului de îmbătrânire în Caenorhabditis elegans

Rolul genelor autofagice în reglarea morții neuronale, a dimensiunii celulare și a procesului de îmbătrânire în Caenorhabditis elegans Disertație doctorală Márton Lóránt Tóth Eötvös Universitatea Loránd Școala doctorală de biologie Școala doctorală de genetică clasică și moleculară Programul de doctorat Programul de doctorat Programul de doctorat Anna Erdei academician Lider de program: dr. László Orosz Supervizor academic: dr. Tibor Vellai Profesor asociat Universitatea Eötvös Loránd Facultatea de Științe Departamentul de Genetică Budapesta 2008

Cuprins CUPRINS 2 LISTA ABREVIERILOR 5 1. INTRODUCERE 6 2. REVIZUIREA LITERATURII 7 2.1. Autofagie 7 2.1.1. Etapele inițiale în reglementarea macroautofagiei 9 2.1.2. Rolul autofagiei în funcția celulară 11 2.2. C. elegans organism model 13 2.3. Boli neurodegenerative 15 2.3.1. Clasificarea bolilor neurodegenerative 15 2.3.2. Modele animale utilizate pentru studierea bolilor neurodegenerative 17 2.3.2.1. Modele bazate pe agregare 17 2.3.2.2. Modele excitotoxice 17 2.4. Reglarea dimensiunii celulei 21 2.5. Biologia procesului de îmbătrânire 24 2.5.1. Societăți de îmbătrânire 24 2.5.2. Teorii ale îmbătrânirii 25 2.5.3. Procesul de îmbătrânire 26 2.5.4. Principalii factori genetici și de mediu care influențează îmbătrânirea 27 2.5.4.1. Calea de semnalizare insulină/IGF-1 27 2.5.4.2. TOR kinază 28 2.5.4.3. Restricție calorică 28 2.5.4.4. Lanțul respirator mitocondrial 28 2.5.4.5. Efectul genelor autofagice asupra duratei de viață 29 2.5.5. Examinarea procesului de îmbătrânire 29 3. OBIECTIVE 31 3.1. Investigația rolului genelor autofagice în neurodegenerare 31 3.2. Investigarea rolului genelor autofagice în reglarea mărimii celulelor 31 3.3. Investigarea rolului genelor autofagice în reglarea procesului de îmbătrânire 31 4. MATERIALE ȘI METODE 33 4.1. Genele autofagice examinate 33 4.2. Întreținerea stocului 34 4.3. Interferența ARN 34 2

6.2. Genele autofagului bec-1 și unc-51 sunt necesare pentru funcția normală a autofagiei în C. elegans 70 6.3. Genele autofagice sunt necesare pentru procesele neurodegenerative induse de degenerină și 6-OHDA 71 6.4. Genele autofagice sunt necesare pentru formarea normală a dimensiunii celulelor la C. elegans 75 6.5. Genele autofagice influențează procesul de îmbătrânire 76 7. REZUMAT 81 8. REZUMAT 82 9. BIBLIOGRAFIE 83 10. MULȚUMIRI 95 4

Figura 1. Principalele tipuri de autofagie. A: în timpul macroautofagiei, unele componente citoplasmatice sunt închise de membrana de izolare rezultată (sechestrare). Membrana exterioară a autofagozomului (primar) sau vacuolului autofagic înconjurată de o membrană de izolare dublă se fuzionează cu lizozomul (fuziune). Pompele de protoni lizozomali acidifică interiorul lizozomului secundar sau autofagolizozomului, activând astfel hidrolazele lizozomale și degradând conținutul (degradare). B: în timpul microautofagiei, componentele citoplasmatice care înconjoară lizozomul, împreună cu membrana lizozomului, intră în interiorul lizozomului (invaginație), unde se degradează (degradare). C: în timpul autofagiei mediate de chaperonă (CMA), proteinele care poartă motivul KFERQ sunt recunoscute de chaperone citoplasmatice (recunoaștere). Complexul proteic chaperonă-substrat este transportat către receptorii de membrană ai lizozomului. Prin receptor, proteina pătrunde în interiorul lizozomului (translocație) și apoi se degradează (degradare). Structurile prezentate în imagine sunt schematice. 8

Figura 2. Etapele inițiale în reglarea macroautofagiei. Activitatea complexului Atg1 necesară inițierii prin complexul TOR este determinată de calea de semnalizare insulină/igf-1 și AMPK. Inițierea necesită și nucleația veziculelor, ale cărei detalii sunt necunoscute. 2.1.2. Rolul autofagiei în funcția celulară Autofagia este un mecanism pentru descompunerea materialelor celulare. Pe lângă proteazom, autofagia este cel mai semnificativ sistem cantitativ de degradare a proteinelor [2]. Activarea acestuia poate fi cauzată de lipsa de energie cauzată de foamete sau de lipsa de aminoacizi și compuși de azot necesari pentru construirea proceselor metabolice sau de acumularea de macromolecule deteriorate. Autofagia joacă un rol important în reglarea multor procese individuale de dezvoltare și citologice. De exemplu, corpul larvelor larvelor Drosophila melanogaster este degradat de autofagie [6], sau de reticulul endoplasmatic și mitocondriile la mamifere după formarea eritrocitelor după ejecția nucleului [7, 8]. Autofagia este necesară în timpul funcției imune a mamiferelor pentru prezentarea antigenului de către MHCII [9, 10]. Acesta joacă un rol în apărarea împotriva agenților patogeni și în uciderea paraziților intracelulari (de exemplu, Mycobacterium, viruși) [11, 12]. 11

Figura 4. Ciclul de viață al C. elegans. Timpul de generație al C. elegans este de doar 3 zile la 25 C. Principalele etape ale ciclului de viață sunt: embriogeneza în ovarul închis; dezvoltarea larvelor, incluzând 4 etape larvare separate prin condiții de repaus numite letarg și aruncarea ulterioară după eclozare, apoi la vârsta adultă. După stadiul larvelor L1, se poate dezvolta un stadiu larvar L3 alternativ, larva Dauer, ca urmare a temperaturii ridicate, a malnutriției sau a așa-numitului feromon de percuție. Cunoștințele acumulate de-a lungul anilor sunt conținute într-una dintre primele baze de date integrate, WormBase (www.wormbase.org). Baza de date cu imagini poate fi accesată la Wormatlas (www.wormatlas.org). Există mai multe surse de literatură actualizate constant în Wormbook (www.wormbook.org). Colecția internațională de bază este menținută la Universitatea din Minnesota (CGC: Caenorhabditis Genetics Center, http://dbw.msi.umn.edu/cgcdb/search.php). Cercetările privind nematodele C. elegans au primit Premiul Nobel pentru Medicină în 2002 (Sydney Brenner, John Sulston și Robert H. Horvitz) și 2006 (Andrew Z. Fire și Craig C. Mello). 14

Figura 13 Proporția persoanelor cu vârsta peste 64 de ani din lume în 2007. (World Population Data Sheet 2007, http://www.prb.org/). 2.5.2. Teorii ale îmbătrânirii Mai multe teorii ale îmbătrânirii s-au născut pe o bază evolutivă și mecanicistă (Tabelul 1). Acestea au examinat de obicei procesul complex de îmbătrânire dintr-o singură perspectivă. Teorii recente au fost dezvoltate pe baza teoriei rețelelor, luând în considerare celelalte teorii [87]. 25

odată cu viteza procesului de îmbătrânire, în timp rezultă tulburări de mișcare și apoi în formă completă paralizie completă. Un alt marker util al îmbătrânirii este raportul intracelular AMP/ATP, care crește treptat pe măsură ce îmbătrânirea celulară progresează [114]. În medicina umană, această metodă a fost utilizată în mod curent de mai bine de 20 de ani [115]). O metodă specifică a C. elegans este măsurarea termotoleranței [116, 117]. Procedând astfel, rezistența animalelor la stresul total de căldură este măsurată prin monitorizarea capacității lor de a rezista la temperatura letală de 35 ° C. Aceasta este legată indirect de capacitatea de a produce proteine de șoc termic, care scade odată cu îmbătrânirea, împreună cu termotoleranța [118]. Studiul pompării faringiene și determinarea frecvenței defecației sunt, de asemenea, specifice pentru C. elegans: ambele arată o scădere odată cu îmbătrânirea [113]. 30

mutațiile care reduc activitatea căilor de semnalizare mediate de insulină/igf sau TOR kinază, funcția mitocondrială și absorbția calorică cresc semnificativ durata de viață la speciile de animale îndepărtate filogenetic. În experimentele mele, am investigat rolul genelor autofagice în îmbătrânire, măsurând speranța de viață și acumularea de pigmenți îmbătrânind și monitorizând degenerarea musculară. Am investigat în continuare interacțiunea dintre genele autofagice și am descris anterior căile genetice implicate în reglarea vieții. 32

Am incubat 6-hidroxidopamină în soluție de acid ascorbic de 10 mm timp de 60 de minute. După tratament, animalele au fost plasate pe o placă goală de NGM. La douăzeci și patru de ore după tratament, numărul de dendrite deteriorate și neuroni dopaminergici morți a fost determinat prin microscopie cu fluorescență. Figura 15. Cei 8 neuroni dopaminergici din C. elegans și proeminențele lor pot fi bine identificați folosind constructul pdat-1: gfp. Figura prezintă o imagine microscopică de fluorescență a corpului anterior, faringelui și zonei înconjurătoare a unui tânăr adult. Dintre cele 8 celule care exprimă transportorul de dopamină DAT-1, doar 6 sunt vizibile, cu 2 neuroni dopaminergici suplimentari (PDEL și PDER) situați în jumătatea posterioară a animalului. Figura 16. Tratamentul cu 6-OHDA face ca proeminențele neuronale dopaminergice să moară și unii dintre neuroni să moară. Acest proces poate fi bine observat la animalele din genotipul pdat-1: gfp prin microscopie fluorescentă. A: Animal tratat cu 6-OHDA din genotipul pdat-1: gfp cu 4 neuroni dopaminergici supraviețuitori (celula ADE 2 nu este focalizată) și resturi fragmentate ale proeminențelor lor. B: genotip animal pdat-1: gfp tratat cu 6-OHDA la un grad mai ridicat de degenerare, cu doar 2 neuroni supraviețuitori. C: animal genotip pdat-1: gfp tratat cu 6-OHDA la care au fost uciși aproape toți neuronii marcați GFP. 37

Celulele moarte și marcate cu GFP au fost întotdeauna numărate la aceeași temperatură la animale dintr-o populație sincronizată cu control. Experimentele au fost efectuate cu un obiectiv microscop Zeiss Axiovert 135 echipat cu optică Nomarski într-o soluție de levamisol de concentrație de 0,1 mm picurată pe o placă subțire de agar formată pe o lamă. De asemenea, am efectuat observații in situ pe plăci NGM cu microscopul Zeiss Axioskop 20 cu obiectiv de mărire 10, 20 și patruzeci. Analiza statistică a datelor obținute a fost efectuată utilizând un test t cu două eșantioane (programul statistic SPSS 14). Diferențele sunt p